A Inseminação Artificial (AI), que se iniciou timidamente em Portugal no ano de 1981, tem registrado uma expansão notável após 1990, sobretudo em empresas suinícolas bem organizadas e dirigidas por empresários dinâmicos e que reconhecem na IA uma ferramenta de grande valia no incremento da produtividade, higiene, genética e mesmo como forma de minimizar os custos de produção.
 
A contaminação ativa do sêmen pode ser notada quando o macho doador padece de uma infecção aguda, com viremia ou bacteriemia, fato que pode ocorrer na ausência de sintomatologia evidente, como a anorexia ou a hipertermia. A contaminação passiva do sêmen pode ser diagnosticada pela deficiente higiene do material utilizado na colheita ou derivar da conspurcação do mesmo por contaminantes facultativos presentes nos divertículos prepuciais (DP) do macho, na urina ou nas fezes.

Contaminação do sêmen por bactérias – A contaminação bacteriana do sêmen é um fato muito usual e que só pode ser evitado através de medidas rigorosas de controle dos machos doadores e da higiene na colheita, o que pressupõe uma formação especializada dos dirigentes dos Centros de IA, circunstancia, aliás, prevista na atual legislação portuguesa.
 
Também pode ser verificada a contaminação bacteriana do sêmen através de bactérias que infectam o macho reprodutor por via sistêmica ou se acantonam nos divertículos prepuciais. A Brucella suis e o Mycobaterium spp (particularmente M. avium) são contaminantes que podem ser localizados nos órgãos genitais dos machos reprodutores. As afecções causadas por estas bactérias encontram-se legisladas, quer em nível nacional (Portugal) ou em nível internacional, sendo impostas restrições aos movimentos de animais quando o exame dos mesmos revela a presença destes agentes.
 
A contaminação do sêmen por certos tipos de bactérias pode ocorrer facilmente no momento da colheita. Todos os tipos de bactérias, usualmente presentes no ecossistema das explorações suínas, tal como E. coli, B. bronchiseptica, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus, Corynebacterium suis (Eubacterium suis) e muitas outras podem ser encontradas no sêmen. A flora bacteriana dos órgãos genitais do macho e do sêmen contem, normalmente, uma grande variedade de agentes potencialmente patogênicos. A sua presença pode ser limitada ou mesmo inibida quando se tomam as devidas precauções.
 
O sêmen tem aparentemente um papel pouco importante na disseminação destas bactérias entre as explorações, dado que são muito comuns em quase todas as explorações convencionais de suínos. As leptospiras constituem uma excreção, existindo um risco potencial de contaminação do sêmen através do trato urinário do macho. O sêmen pode assim ser o disseminador da leptospirose entre as explorações.
 
As bactérias provocam, geralmente, poucos problemas reprodutivos após a inseminação quando estão presentes em pequenas quantidades (10 bactérias por ml de sêmen diluído), embora constituam um fator de risco em relação à prolificidade da fêmea (Madec e Vannier, 1989; Perestrelo-Vieira, 1993). Os mecanismos de defesa não-específicos do útero das fêmeas são muito potentes durante o cio, especialmente os baseados na ação dos polimorfonucleares, que atuam eliminando o excesso de sêmen e os corpos estranhos, incluindo vírus e bactérias (Hare, 1985).
 
Devido provavelmente a estes mecanismos de defesa não-específicos, a patogenicidade do sêmen infectado no trato reprodutivo das fêmeas parece reduzido mesmo quando se contamina com Corynebacterium suis (E. suis) ou outros agentes, desde de que se utilize o sêmen durante a fase éstrica da fêmea.
 
Nesse sentido, foram realizados experimentos em que foram inoculadas culturas puras de E. Coli por via vaginal durante o estro e o metaestro. A estirpe utilizada foi reisolada de fêmeas com endometrite bacteriana. No entanto, três semanas depois não se detectou endometrite nem se reisolaram as bactérias inoculadas durante a fase éstrica. Por outro lado, verificou-se a excreção vaginal e endometrite em três das cinco fêmeas em que a inoculação se tinha registrado no metaestro proximal, 12 horas após o final do período de cio externo (Pensaert, 1992).
 
Pode-se concluir que a fase do ciclo éstrico na fêmea tem um papel decisivo na determinação da infecção bacteriana. A partir destes dados pode-se chegar a conclusão de que o útero das fêmeas é susceptível às infecções bacterianas logo após o desaparecimento dos sinais externos de cio (metaestro), período que corresponde ao momento em que os níveis de estrógenos plasmáticos diminuem e os níveis de progesterona aumentam.
 
Nas situações em que as fêmeas são inseminadas várias vezes, ou em que o cio não é cuidadosamente controlado, é possível observar a indução de endometrite e descargas vaginais devido ao uso de sêmen contaminado por bactérias.
 
A base de qualquer controle passa por medidas que incluem as regras básicas de higiene, a fim de eliminar a contaminação bacteriana durante a co1heita do sêmen, processamento, armazenamento e tratamento do mesmo com antibióticos adequados. Alguns autores (Serrano e col., 1994) aconselham ainda a elaboração periódica de antibiogramas do sêmen.
 
A contaminação excessiva, originando quebras da fertilidade, é causada quando não se respeitam as medidas higiênicas na manipulação do sêmen e quando a inseminação não se processa durante a fase de cio pleno (Madec e Vannier, 1989).
 
É necessário relevar alguns aspectos importantes para garantir a qualidade do sêmen, tais como o alojamento dos suínos doadores, a higiene do equipamento utilizado, a detecção do cio o estatuto imunitário das porcas e as qualidades do inseminador. O exame bacteriológico do sêmen, para detectar contaminantes específicos, pode ser um recurso de elevado interesse.
 
O caso particular do Eubacterium suis merece ser destacado e levado em consideração, sobretudo após os resultados recentes obtidos em Portugal (Perestelo - Vieira e col., 1993). Na realidade, nesse estudo epidemiológico, do tipo sondagem de infecção, foi detectada uma prevalência elevada de E. suis nos DP dos machos estudados. O teste utilizado (imunofluorescencia – IFI) foi efetuado em esfregaços obtidos a partir de zaragatoas (instrumento utilizado para aplicar remédios na garganta ou fossas nasais do animal) dos DP dos machos estudados.

Contaminação do sêmen com vírus – Os mecanismos de defesa não-específicos do útero das porcas podem ser menos eficazes contra alguns vírus do que contra as bactérias, já que os vírus podem se duplicar no útero ou no embrião em crescimento. Deste modo, alguns vírus podem escapar aos mecanismos inespecíficos de defesa, mesmo quando se processa a IA em plena fase éstrica.
 
Alguns vírus podem contaminar o sêmen durante a fase de viremia do suíno. Na realidade, todos os vírus que originam uma fase de viremia podem, teoricamente, infectar o sêmen. É o caso do vírus da febre aftosa (VFA), o vírus da doença vesicular suína (VDVS), vários Enterovírus suínos (EVS), o vírus da peste suína clássica (VPSC), o vírus da peste suína africana (VPSA), o Parvovirus suíno (PVS), o vírus da doença de Aujeszky (VDA) e o vírus da síndrome reprodutiva e respiratória suína (VSRRS). O vírus da febre aftosa, o vírus da doença vesicular e o vírus da peste suína clássica e africana provocam afecções que se encontram sujeitas a regulamentação nacional e internacional, uma vez que a possibilidade de o sêmen propagar estes agentes em circunstâncias normais é baixa. As medidas sanitárias e as restrições legais que são impostas quando um país ou região se infecta, são suficientes para pelo menos minimizar os riscos potenciais de disseminação dessas doenças.
 
No entanto, outros vírus bastante difundidos em vários países (VDA, PVS, EVS e VSRRS) não estão sujeitos a regulamentação severa na maioria dos países da União Européia e não são controlados regularmente (exceto o VDA em alguns países).

Enterovírus suínos (EVS) – Todos os enterovírus estão amplamente difundidos nos países produtores de suínos. Existem vários serotipos de EVS associados com a vesiculite seminal do macho.
 
Normalmente, a infecção ocorre por meio de via oral. A transmissão de um animal para outro é feita através da via oral ou fecal. Durante a infecção pode ocorrer a viremia e os enterovírus podem atingir o trato genital dos machos reprodutores. Embora se afirme que alguns enterovírus aumentam as formas anormais de espermatozóides e diminuem a libido, tais fatos raramente ocorrem em condições de campo, onde o animal tem muitas possibilidades de serem infectados com a maioria dos serotipos de enterovírus existentes, antes da chegada da puberdade. Ou seja, durante o desmame e o período de crescimento do suíno. A possibilidade de que um suíno seja infectado pela primeira vez durante a fase da puberdade é muito remota.
 
Estes enterovírus não provocam sintomas evidentes no animal adulto e a infecção do esperma é muito rara. Se esta infecção ocorrer pela primeira vez durante a puberdade e se o enterovírus atingir o sêmen, nenhum efeito sobre a reprodução do macho e da fêmea coberta ou inseminada é observado (Pensaert, 1992).
 
Nos estudos experimentais o sêmen contaminado com enterovírus não induziu a perturbações patogênicas nem no útero nem no embrião. Parece que o vírus não se multiplica no endométrio e é inativado, provavelmente, pela temperatura corporal da fêmea no momento em que se perde a zona pelúcida protetora do embrião (Turek e col., 1983).
 
De forma similar, os enterovírus não atuam na transferência de embriões, mesmo quando se utiliza sêmen contaminado. Nos embriões, previamente inoculados com enterovírus, estes penetram na zona pelúcida e associa-se aos espermatozóides fixados em sua superfície externa. Assim, a infecção dos blastômeros não é verificada (Turek e col., 1983).
 
Por segurança deve-se tomar certas precauções utilizando machos reprodutores soropositivos como reprodutores ou doadores de sêmen. Na prática, os enterovírus não são considerados como contaminantes do sêmen nem a disseminação do vírus provoca infertilidade. O efeito sobre o feto só ocorre quando existe viremia com infecção transplacentária.

Parvovirus suíno (PVS) – Este agente registra uma difusão universal, sendo comum entre os suínos de todas as regiões do mundo. Ele é um dos principais causadoras de problemas reprodutivos nas fêmeas (Perestelo - Vieira, 1987), sendo isolado do sêmen com relativa facilidade.
 
A via usual de infecção dos suínos não-imunes é a via oro-nasal, sendo vulgar a transmissão venérea. Os machos reprodutores sensíveis, que são infectados pela primeira vez na puberdade (fase de maturação sexual), exibem viremia, e o PVS pode atingir os órgãos genitais e contaminar o sêmen (Bonte e col., 1984). O PVS tem sido isolado de machos de monta natural, não ficando claro se o vírus procedia do próprio ejaculado ou da contaminação do prepúcio ou do DP, por sua vez infectado através das fezes.
 
Quando inoculado via oro-nasal, o PVS pode ser isolado nas glândulas vesiculares, mas não de outras partes do aparelho genital masculino, embora possa aparecer no ejaculado (Wrathall e Mengeling), 1983.
 
No suíno macho não se produzem sintomas de doença ativa, nem problemas de fertilidade, e o vírus só está presente no sêmen durante a fase virêmica, que é efêmera (3 a 5 dias), sendo eliminado quando o suíno adquire imunidade, não existindo, portanto, excreção permanente do vírus.
 
A contaminação do sêmen pelo PVS é viável e pode verificar-se em machos jovens, de sete a oito meses, que foram infectados de forma natural, após a puberdade e que não foram vacinados. Embora o PVS esteja extremamente difundido, não está sempre presente em todas as unidades de produção com existência de modelos epidemiológicos bem característicos (Perestrelo - Vieira, 1987). A utilização de sêmen contaminado pode, eventualmente, ser responsável por um surto de Parvovirose em explorações indenes e onde o vírus não circula. O sêmen pode, em certas circunstâncias, ser a causa de um foco que pode assumir uma importância maior ou menor em função do modelo de difusão viral, da estrutura etária da exploração e da dimensão da mesma.
 
A transmissão do vírus por via seminal parece ser uma conseqüência normal da inseminação. A importância do sêmen contaminado por PVS em provocar problemas reprodutivos nas fêmeas em condições de campo não é linear (Thacker e col., 1984).
 
As porcas soronegativas inseminadas com sêmen contaminado com PVS podem registrar fertilidade baixa mesmo quando o vírus parecer não afetar o endométrio. Mesmo nas fêmeas nulíparas soropositivas expostas ao PVS (através do sêmen contaminado), que podem não estar completamente protegida contra a doença, o risco de problemas reprodutivos causados pelo sêmen contaminado com o PSV é muito baixo.
 
Quando o PVS é adicionado em óvulos fertilizados in vitro não se verifica infecção do embrião. O vírus associa-se aos espermatozóides situados na superfície da zona pelúcida, não existindo evidencia da infecção nos blastômeros ou no embrião. Aparentemente o sêmen contaminado com PVS só pode provocar morte embrionária se o vírus permanecer no útero até o embrião perder a zona pelúcida e a possibilidade disso ocorrer em condições de campo é muito baixa. Tudo indica que a infecção da zona externa do óvulo ocorre no momento da penetração do espermatozóide com o vírus absorvido.
 
A hipótese de que surjam problemas de foco reprodutivo (morte embrionária com reabsorção, retorno ao cio e ninhadas pequenas) parece reduzida, não podendo, no entanto, ser excluída totalmente.
 
O PVS pode ser veiculado através de óvulos fertilizados existindo a possibilidade de afetar a transferência de embriões. O vírus pode penetrar nas partes profundas do embrião sem ser eliminado ou tratado pela tripsina ou soro anti-PVS, sem demonstrar, porém, qualquer efeito nocivo no desenvolvimento do embrião.
 
Para minimizar o risco de transmissão através do sêmen de machos reprodutores recentemente infectados recomenda-se a utilização de animais soropositivos. A soropositividade pode ser o resultado de uma infecção anterior à puberdade ou a vacinação. Não se pode assegurar que tenha havido uma infecção natural antes da puberdade, porque o PVS pode estar ausente temporariamente numa dada unidade, tanto mais que os anticorpos de origem materna, de larga duração, podem prevenir a infecção em idade jovem. A soropositividade evita a viremia no suíno durante a infecção.
 
De forma similar, a inseminação deveria ser realizada em fêmeas com anticorpos do PVS. A excreção viral pelas fezes pode ocorrer mesmo em machos vacinados, não excluindo a contaminação fecal no sêmen.

Vírus da doença de Aujeszky (VDA) – O VDA foi isolado do sêmen após a infecção natural de machos indenes e também, após a inoculação experimental em suínos vacinados. Do mesmo modo, também se isolou o VDA do prepúcio de machos durante vários dias após a sua inoculação direta na mucosa prepucial (Gueguen e col., 1980).
 
A infecção natural do suíno macho pelo VDA pode causar doença ativa, originando perturbações na qualidade do sêmen. O sêmen não contém necessariamente o VDA, podendo, entretanto, surgir uma queda temporária na fertilidade devido aos efeitos da elevada temperatura corporal sobre a espermatogênese, durante a fase de doença clínica aguda (hipertermia). Após a inoculação oro-nasal experimental e, também, após a infecção natural, o VDA pode causar lesões acompanhadas de inflamação testicular que provoca a infertilidade. Após a inoculação intratesticular notou-se que os vírus se duplicam nas células da túnica vaginal produzindo periorquite (MYRY e col., 1987; Hall, 1983).
 
O VDA também tem sido isolado do sêmen de suínos vacinados e de suínos sem sinais clínicos da doença. A origem do vírus permanece obscura não descartando a contaminação a partir do prepúcio ou divertículos prepuciais. O VDA pode replicar localmente na mucosa prepucial sem causar lesões (Hall, 1983).
 
O VDA também pode ser transmitido através do sêmen, originando não apenas casos de infecção aguda como também estados clínicos inaparentes. A reativação do vírus em tecidos genitais pode originar a contaminação do esperma muito tempo após a infecção aguda. Neste caso, o risco de que o sêmen seja uma fonte importante de disseminação do VDA é elevado.
 
O exame do sêmen para detectar a presença de VDA não é realizado como qualquer outro exame de rotina. Por isso, para obter a segurança de não estar propagando a infecção é aconselhável utilizar o sêmen de machos sorologicamente negativos como, aliás, é imposto pela legislação portuguesa.
 
O problema que subsiste é que não se pode excluir uma infecção recente do suíno seguida de uma possível contaminação do sêmen.
 
O VDA, depois da deposição no útero, pode provocar reações inflamatórias severas originando uma implantação deficiente do óvulo fertilizado. A capacidade de replicação do vírus persiste algum tempo no útero afetando o embrião depois de se perder a zona pelúcida. O VDA pode criar problemas reprodutivos em porcas, mesmo nas vacinadas, cuja inseminação com sêmen contaminado sempre causou problemas de reprodução.
 
Na transferência de embriões infectados com VDA verifica-se a absorção viral na zona pelúcida, sendo viável a sua replicação depois do desaparecimento daquela zona sete dias após a fertilização. O efeito da lavagem do embrião, com soro anti-VDA, depende do conteúdo de anticorpos e quantidade de vírus absorvidos. Assim, quando a quantidade de vírus presente no embrião é muito baixa em circunstâncias naturais, a lavagem do embrião parece prevenir de forma efetiva a transmissão de VDA (Hare, 1995).

Vírus da síndrome respiratória e reprodutiva no suíno (VSRRS) – Este vírus surgiu recentemente em vários países europeus como Alemanha, Holanda, Bélgica, Reino-Unido, França, Dinamarca e Espanha, parecendo tornar-se enzoótico onde a produção de suínos é intensiva e o número de focos é muito alto (Perestrelo - Vieira e col., 1992).
 
A participação do macho infectado indica essencialmente no ejaculado uma diminuição do número de espermatozóides, da sua mobilidade e aumento de células anormais. É seguro que o macho transmita a doença se o sêmen for colhido na fase virêmica (Edwards e col., 1992).
 
O vírus penetra pela via oro-nasal podendo duplicar no trato respiratório, particularmente nos macrófagos alveolares. O vírus ultrapassa a barreira placentária e pode se multiplicar nos fetos provocando placentite multifocal.
 
Quando atinge o útero grávido a ação do vírus resulta em mortalidade embrionária, com retornos tardios ao cio, mortalidade fetal com aborto, fetos mumificados, macerados ou natimortos (Perestrelo - Vieira e col., 1992).
 
O retorno ao cio é um problema comum durante a evolução clínica de um foco de SRRS. Não se sabe se isto é devido à baixa qualidade do sêmen proveniente de machos reprodutores afetados ou ao efeito do sêmen contaminado. Não se conhece o efeito do VSRRS sobre o embrião em desenvolvimento nem sobre o útero após a inseminação. O sêmen contaminado pode ser considerado como uma fonte de difusão de VSRRS e como causa de problemas de fertilidade.

Discussão – O exame bacteriológico do sêmen é viável embora o exame virulógico seja difícil. O sêmen está normalmente infectado por bactérias que originam a contaminação das culturas celulares. O isolamento dos vírus é, também, complicado pela presença de fatores seminais que são tóxicos para as células. Existem fatores antivirais no sêmen que inativam, de forma não específica, ou inibem, a replicação viral. Todos esses fatores estão associados à fração fluida do ejaculado. As tentativas de eliminar os fatores citotóxicos com diferentes métodos não obtiveram sucesso.
 
Os resultados mais interessantes foram obtidos através da inoculação em animais sensíveis. No caso do VDA a inoculação em coelhos parece melhor que as culturas celulares para demonstrar a presença do vírus do sêmen.
 
A PCR (Polimerase Chaine Reaction) em que os vírus podem ser detectados em pequenas quantidades, sem necessidade de culturas celulares, pode vir a ser um método de futuro. Não se encontram anticorpos no sêmen mesmo quando há títulos altos no soro do macho. Este fato foi demonstrado para o VDA em machos vacinados. Os Anticorpos podem, no entanto, estar presentes no sêmen após uma infecção local dos órgãos genitais, não parecendo que se produz transudação a partir do sangue.
 
Não se pode esperar que se produza a neutralização dos vírus que contaminam acidentalmente o sêmen durante a co1heita. Os fatores inibidores virais que estão presentes no sêmen podem ter um efeito benéfico, minimizando a transmissão venérea quando se verifica uma contaminação de baixo nível, supondo que a infecção natural do sêmen resulte de pequenas quantidades de partículas virais.
 
Os suínos machos utilizados na reprodução ou na IA podem originar doenças em regiões ou países isentos delas (brucelose, tuberculose, febre aftosa, doença de Aujeszky). Em países em que estas afecções são enzoóticas, é preferível a utilização de machos reprodutores de unidades indenes.

Recomendações (Pensaert, 1992) – No caso do VDA, se não for possível utilizar machos reprodutores soronegativos é recomendável a vacinação dos mesmos com vacinas "deletadas" inativadas. Quando esses machos já vacinados são infectados, a replicação viral pode ser verificada na mesma, mas de uma forma reduzida que torna a contaminação no sêmen pouco provável. No entanto, o efeito das possíveis reativações virais de curta duração não podem ser evitadas. Em estados ou regiões indenes de DA e em que não se pratica a vacinação, não existem restrições na exportação de sêmen, devendo, porém, todos os suínos machos reprodutores dos Centros de Inseminação Artificial serem soronegativos. Deve-se realizar provas sorológicas periódicas de três em três meses em todos os animais, inclusive na entrada e na saída dos respectivos centros. Em outras regiões, reconhecidamente infectadas, devem ser praticados exames sorológicos de elevada sensibilidade para prevenir a difusão por via IA. Isto possibilita detectar os suínos infectados e auxilia a minimizar o risco da exportação de sêmen contaminado com o VDA, já que não se conhece qual a dose viral mínima necessária para iniciar a infecção nas porcas após a inseminação.
 
Os métodos de isolamento do vírus no sêmen são demorados e falíveis devido a toxicidade do sêmen para as culturas celulares. A excreção viral no sêmen é observada durante a infecção aguda, em que os machos infectados excretam grandes quantidades de vírus durante um período de tempo superior ao verificado nas secreções naso-faríngeas. Se a excreção do vírus pelo sêmen resultar da reativação da infecção, poder-se-á supor que o vírus também esteja presente nas secreções nasais.
 
No caso do parvovirus, que está amplamente difundido, recomenda-se a utilização de machos com uma forte imunidade ativa após a vacinação ou a infecção natural. O estado imunitário pode ser avaliado por sorologia dado os altos níveis de anticorpos séricos (Perestrelo-Vieira, 1987).
 
No caso do VSRRS a única medida de controle é colher o sêmen apenas de machos soronegativos. Numa unidade infectada enzooticamente é difícil prevenir a contaminação, uma vez que não se sabe se o VSRRS pode ser excretado pelo sêmen de suínos imunizados e nem a o tempo de duração dessa excreção. Também não é conhecido o fato de a imunidade após primeira infecção ou a vacinação ser suficiente para que os machos recém infectados constituam um risco de disseminação do vírus e de indução de problemas reprodutivos.
 
A base de qualquer controle passa por medidas básicas de higiene a fim de eliminar a contaminação bacteriana durante a colheita do sêmen, processamento, armazenamento e tratamento com antibióticos. A contaminação microbiana excessiva, originando quebras na fertilidade, pode ser diagnosticada quando não há a prática de medidas higiênicas na manipulação do sêmen, do diluidor e quando a inseminação não se processa durante a fase de cio pleno.
 
O exame periódico do sêmen pode ser efetuado para detectar contaminantes específicos. A inoculação em animais sensíveis pode ser útil, em caso de suspeita da DA, mas não se pode realizar de forma rotineira. A utilização de sêmen na mesma exploração onde se processa a colheita, sem haver o cumprimento básico de higiene representa um baixo risco de propagação de novas doenças, embora possa constituir a base de algumas contrariedades do foco reprodutivo, retornos ao cio, abortos precoces, ninhadas pequenas e infecções do trato genital. Fica aqui o questionamento sobre o excesso de confiança que é dado aos antibióticos presentes nos diluidores. Desta forma, problemas esporádicos do tipo reprodutivo são notados no momento da colheita do sêmen em suínos com infecções agudas, particularmente com VDA e VSRRS.

*Médico veterinário do Instituto de Pesquisa Agropecuária de Portugal e
*Médico veterinário do Instituto de Experiências Agropecuárias e Desenvolvimento Rural.